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貼壁細胞傳代培養

來源:admin  瀏覽量:  發布時間:2018-12-18 13:42:56


本視頻為普諾賽貼壁細胞凍存操作指南,對每一步操作都做了演示,以便實驗者更好地理解貼壁細胞凍存實驗過程。

貼壁細胞凍存實驗準備:
15mL離心管、凍存管、PBS緩沖液、移液管、電動移液器等物品提前放入生物安全柜中,紫外照射30min消毒滅菌;
細胞完全培養基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、細胞凍存液等從4℃冰箱中取出后,復溫至室溫,備用;程序降溫盒復溫至室溫備用。


貼壁細胞凍存操作步驟:
1. 從培養箱中取出準備凍存的細胞;
2. 顯微鏡下觀察細胞狀態并拍照記錄;
3. 酒精消毒培養瓶后放入安全柜中;
4. 吸去多余的培養基,加人2~3ml PBS緩沖液潤洗一次;
5. 加入1ml胰酶,放入37℃消化;
6. 消化1min左右,在顯微鏡下觀察細胞消化情況;  
7. 消化完全后,加3ml完全培養基終止;
8. 將細胞懸液移入15ml離心管中離心,1000rpm/min(約200g)離心3-5min;
9. 吸去多余的液體,向細胞沉淀中加入適量的凍存液,輕輕吸打混勻;
10. 按比例分裝至凍存管中;
11. 貼好標簽后放入梯度凍存盒中;
12. 將凍存盒放入-80℃,降溫過夜后,移入液氮中保存。


注意事項:
1)細胞凍存液需提前配制,不可直接將DMSO加入細胞懸液中;
2)不同細胞消化時間有差異,以實際鏡檢結果為準,大部分細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可中止消化,消化時間不宜過長;
3)應選擇匯合度80%-90%左右,細胞處于對數生長期時進行凍存操作,確保細胞凍存時狀態最佳,凍存密度可根據細胞特性進行調整;
4)凍存細胞保存溫度應低于-130℃,不可在-80℃長期保存。

 

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